中国医学科学院药用植物研究所实验总结报告II


日期:2014-01-26
作者:bailing
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总结报告研究专题的名称:糖宁通络胶囊对db/db自发性糖尿病小鼠降糖作用及糖尿病并发症的影响实验报告

 

本试验采用db/db自发性糖尿病小鼠模型作为研究工具,对糖宁通络胶囊的降糖作用进行了评价研究。第一次试验采用雄性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后测定血糖,确认模型血糖异常,给药(糖宁通络胶囊和二甲双胍)处理4周,从给药第一天开始,每天记录动物一般状况,摄食量和饮水量,每周测定血糖,在末次给药后测定糖耐量、血清胰岛素和血脂等指标,同时对主要脏器进行病理检查。第二次试验采用雌性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后测定血糖,确认模型血糖异常,给药处理12周,从给药第一天开始,每天记录动物一般状况,摄食量和饮水量,每周测定血糖,在给药第11周测定尿蛋白,眼底视网膜荧光检查,在末次给药后测定糖耐量,麻醉动物取血清测定糖化血红蛋白、肝功能肾功能和心肌酶等指标,同时对主要脏器进行病理检查。实验结果:

1.降糖活性评价

第一次试验,采用雄性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药4周处理实验结果,阳性药物(二甲双胍,剂量0.12g/kg)和糖宁通络组(三个剂量,分别为1.8、3.6和7.2g/kg)与模型组比较空腹血糖均有统计学差异(p<0.05), 糖宁通络组与二甲双胍组比较空腹血糖均无统计学差异(p>0.05),糖宁通络三个剂量组与二甲双胍组(0.12g/kg)降糖作用强度相当;糖宁通络组剂量与降糖效果存在量—效关系。给药4周处理实验对糖耐量影响的结果,与C57正常对照组比较,模型组不同时间点的血糖均显著升高。给药组服用葡萄糖后各时间点血糖值均升高,与模型组比较有降低趋势,均但无统计学差异;与模型组比较,给药组服用葡萄糖后血糖-时间曲线下面积(AUC)降低,与模型组比较有统计学差异(p<0.05)。糖宁通络胶囊(1.8、3.6和7.2g/kg)具有与二甲双胍(0.12g/kg)强度相当的强血糖作用, 同时显著改善糖耐量。

第二次试验,采用雌性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药12周后处理实验结果,阳性药物(二甲双胍,剂量0.12g/kg)和糖宁通络组(三个剂量,分别为0.9、1.8和3.6g/kg)与模型组比较空腹血糖均有统计学差异(p<0.05),糖宁通络组与二甲双胍组比较,空腹血糖均无统计学差异(p>0.05),糖宁通络组(0.9、1.8和3.6g/kg)与二甲双胍组(0.12g/kg)降低空腹血糖作用强度相当;阳性药物(二甲双胍,剂量0.12g/kg)和糖宁通络组(三个剂量,分别为0.9、1.8和3.6g/kg)与模型组比较糖化血红蛋白均有统计学差异(p<0.05),糖宁通络组(三个剂量,分别为0.9、1.8和3.6g/kg)与二甲双胍组比较糖化血红蛋白均无统计学差异(p>0.05),糖宁通络胶囊(0.9、1.8和3.6g/kg)、二甲双胍组(0.12g/kg)具有显著的降低糖化血红蛋白的作用,糖宁通络胶囊高剂量组(4.913±1.465,n=12)降低糖化血红蛋白作用略优于二甲双胍组(5.197±1.065,n=12),糖宁通络胶囊降低糖化血红蛋白作用具有明显的剂量依赖性。给药12周处理实验对糖耐量影响的结果,与C57正常对照组比较,给药组服用葡萄糖后血糖-时间曲线下面积(AUC)均显著升高;与模型组比较,给药组服用葡萄糖后血糖-时间曲线下面积(AUC)升高幅度较低,与模型组比较有统计学差异(p<0.05);与二甲双胍组比较,糖宁通络组服用葡萄糖后血糖-时间曲线下面积(AUC)显著降低,具有统计学差异(p<0.05)。糖宁通络胶囊(0.9、1.8和 3.6g/kg)显著改善糖尿病小鼠糖耐量的作用,作用优于二甲双胍组(0.12g/kg)。

2.对肝脏损伤和脂质代谢的影响

第一次试验,采用雄性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药4周处理实验结果,阳性药物(二甲双胍,剂量0.12g/kg)和糖宁通络组(三个剂量,分别为1.8、3.6和7.2g/kg)与模型组比较血脂四项均无统计学差异(p<0.05)。肝脏病理检测结果,模型组肝细胞损伤主要以脂肪变性和水肿为主,各给药(糖宁通络胶囊和二甲双胍)治疗组有一定缓解肝细胞损伤的作用趋势。

第二次试验,采用雌性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药12周后处理实验结果,与C57正常对照组比较,db/db小鼠模型组总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)显著升高(p<0.05)。与db/db模型组小鼠比较,糖宁通络组(1.8和3.6g/kg)能显著降低TG和CHO,有显著差异;能降低LDL,高剂量组(3.6g/kg)有显著性差异。对HDL有升高的趋势,但无统计学差异。对肝功能指标影响结果表明,与C57正常对照组比较,db/db小鼠模型组肝功能指标显著升高,有统计学差异。与db/db模型组小鼠比较,糖宁通络组能显著降低GTP和GOT,有统计学差异。肝脏病理检测结果,模型组和给药组肝细胞损伤严重以气球样变和脂肪变性为主,各给药(糖宁通络胶囊和二甲双胍)治疗组无缓解肝细胞损伤的作用趋势。

3.对血清胰岛素与胰腺的影响

第一次试验,采用雄性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药4周处理实验结果,阳性药物(二甲双胍,剂量0.12g/kg)和糖宁通络组(三个剂量,分别为1.8、3.6和7.2g/kg)与模型组比较血清胰岛素均无统计学差异(p<0.05)。胰腺病理检测 结果,模型组胰岛体积缩小和局限性增生,各给药(糖宁通络胶囊和二甲双胍)治疗组有一定缓解胰岛细胞损伤的作用趋势。

第二次试验,采用雌性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药12周后处理实验结果,阳性药物(二甲双胍,剂量0.12g/kg)和糖宁通络组(三个剂量,分别为0.9、1.8和3.6g/kg)与模型组比较对血清胰岛素均无统计学差异(p<0.05)。胰腺病理检测 结果,模型组胰岛体积增大,胰岛内细胞核数目增多,但胰岛形态及其基本结构未见异常,各治疗组病变损伤程度较模型组比较均有防治缓解趋势。

4.对糖尿病肾病及肾功能的影响

第一次试验,采用雄性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药4周后进行肾脏病理检查,综合镜检和定量观察结果提示二甲双胍和糖宁通络胶囊治疗组防治糖尿病肾病疗效肯定,糖宁通络胶囊无剂量依赖性。

第二次试验,采用雌性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药12周后处理实验结果,与C57正常对照组比较,db/db小鼠模型组血清肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)显著升高(p<0.05)。阳性药物(二甲双胍,剂量0.12g/kg)与模型组比较均无统计学差异(p<0.05)。糖宁通络组(三个剂量,分别为0.9、1.8和3.6g/kg)与模型组比较血清尿素氮均有统计学差异(p<0.05)。糖宁通络高剂量(3.6g/kg)组与模型组比较血清肌酐有统计学差异(p<0.05)。糖宁通络胶囊能一定程度降低肾功能损害。同时对小鼠尿蛋白进行半定量检测,模型组和二甲双胍组尿液蛋白检测结果为阳性(+++),糖宁通络胶囊组尿液蛋白检测结果为阳性(++),糖宁通 络胶囊有一定程度的降低糖尿病并发的肾功能损害。给予药物处理12周后肾脏病理检查,综合镜检和定量观察结果提示:肾脏可逆性损伤主要以肾小管上皮细胞水肿为主,肾小球均未发现异常,各治疗组病变损伤程度较db/db模型组比较均有防治缓解趋势。糖宁通络胶囊治疗组防治糖尿病肾病疗效肯定,糖宁通络胶囊无剂量依赖性。

5.糖尿病眼底病变的影响

第一次试验,采用雄性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药4周后进行眼底病理检查,综合镜检和定量观察结果提示二甲双胍和糖宁通络胶囊治疗组防治糖尿病眼底病变疗效不明显。

第二次试验,采用雌性6~8周龄db/db自发性糖尿病小鼠作为模型,饲养一周后开始给药,给药12周后处理实验结果,眼底荧光造影结果:正常组无微血管瘤;模型组微血管瘤遍布网膜二甲双胍组(0.12g/kg)组与模型组无明显差异;糖宁通络胶囊各剂量(0.9、1.8和3.6g/kg)组微血管瘤数量减少,且中剂量组减少最为明显;视网膜厚度方面:整体网膜厚度无明显变化,但模型组与二甲双胍组神经纤维层厚度变薄;而糖宁通络胶囊各剂量组,神经纤维层厚度均好于模型组。眼底病理检查结果提示db/db模型组视网膜眼底病变主要以神经节细胞层神经元丢失胶质细胞增生为主,其余各层细胞与各层结构未见异常改变,二甲双胍和中药受试物低剂量治疗组病变损伤程度与db/db模型组相似未有防治缓解趋势,中药受试物高剂量治疗组和中药受试物中剂量治疗组较模型组干预防治效果明显,具有缓解减轻的趋势。

综上所述,糖宁通络胶囊具有较好的降糖作用,在本实验条件下与二甲双胍作用强度没有差异,显著改善糖耐量,作用优于二甲双胍,纠正糖代谢和脂质代谢紊乱;延缓微血管并发症的发生,眼底荧光造影和病理检查均提示糖宁通络胶囊对糖尿病并发的眼底病变作用明确,延缓糖尿病并发的肾病。讨论在药效学评价研究中动物实验是较为常用的模型之一,糖尿病模型主要分为:实验性、自发性和转基因糖尿病动物三类模型。自发性糖尿病动物其临床表现与人类糖尿病相似,可用于研究糖尿病的病因和发病机制,也可用于筛选糖尿病药物及研究其作用机制,是较理想的糖尿病模型。db/db小鼠由C57BL/KsJ近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而来,属2型糖尿病模型,其体型极胖,在一个月时开始贪食及发胖,继而产生高血糖、高血胰岛素,胰高血糖素也升高,一般在10个月内死亡。自发性糖尿病小鼠能较好地表现出2型糖尿病患者的临床症状,是进行糖尿病发病机理研究和降糖药筛选的良好动物模型,是国内外较为认同的一种模型。

本试验采用了自发性糖尿病小鼠模型作为研究工具,对糖宁通络胶囊的降糖作用进行了重复评价研究。从动物行为状况,血糖、糖化血红蛋白、糖耐量、血清胰岛素和血脂等生化指标,眼底荧光造影和主要脏器进行病理检查等多角度来评价糖宁通络胶囊对2型糖尿病db/db小鼠的降糖活性及糖尿病合并症干预作用。

糖尿病的治疗和处理的主要终点是通过血糖控制达标来延缓和减少并发症的发生。研究表明HbA1c每下降1%,微血管并发症(眼、肾、神经病变)的发生率降低37%,急性心肌梗死、卒中和充血性心力衰竭发生率下降6~12%。改善糖代谢和脂代谢异常对糖尿病及并发症的治疗具有重要的意义。通过每周一次的持续血糖监测、糖化血红蛋白测定和糖耐量测定二次试验重复验证了糖宁通络胶囊对2型糖尿病db/db小鼠的降糖活性。在实验条件下,糖宁通络胶囊(0.9、1.8和3.6g/kg)与二甲双胍(0.12g/kg)降低血糖作用强度没有差异,显著改善糖耐量,作用优于二甲双胍。通过胰腺病理检测结果提示,糖宁通络胶囊对胰岛病理损伤程度有减轻作用。通过两次血脂生化指标检测和肝脏病理检查,结果提示糖宁通络胶囊给药12周对脂质代谢异常有一定的干预作用。第一次没有使用高脂、高糖小鼠饲料喂养,病理结果提示对肝脏细胞损伤有一定保护作用趋势;第二次使用高脂、高糖小鼠饲料持续养12周,肝脏脂肪病变严重,病理 结果提示各组肝脏细胞气球样变和脂肪变性严重,糖宁通络胶囊和二甲双胍均未表现出保护作用;血脂水平检测结果提示糖宁通络组(1.8和3.6g/kg)能显著降低TG和CHO,有显著差异;能降低LDL,高剂量组(3.6g/kg)有显著性差异,一定程度能改善脂质代谢异常。

 

糖尿病并发微血管病变是糖尿病视网膜、糖尿病肾病、糖尿病性神经病等微细管病变共同的病理基础。其中微血管障碍、微血管瘤形成和微血管基底膜增厚是2型糖尿病微血管病变的典型病理改变。微血管病变是糖尿病病人特有的慢性并发症,在糖尿病微血管病变中糖尿病视网膜约34.3%,糖尿病肾病约33.6%,糖尿病性神经病约60.3%;是影响2型糖尿病病人生存质量的主要因素,是致残、致死的重要原因之一。通过眼底荧光造影图像显示:二甲双胍组和模型组眼底微血管瘤遍布视网膜,糖宁通络组微血管瘤数量较模型组减少,其中,中剂量减少最为显著;对于视网膜厚度的影响,模型组与二甲双胍组神经纤维层厚度变薄,而糖宁通络各剂量组,神经纤维层厚度均好于模型组。微血管瘤是糖尿病视 网膜病变(非增殖期)的最早表现,是视网膜毛细血管囊样扩展引起。糖宁通络能显著抑制微血管瘤形成和视神经纤维的损害。糖尿病视网膜病变根本原因是机体糖代谢紊乱与微循环障碍,视网膜局部血管刺激因素与抑制因素之间的平衡破坏是引发视网膜屏障破坏、新生血管形成的直接原因,提示糖宁通络抑制微血管瘤形成的作用可能与其改善糖代谢紊乱和微循环障碍有关。通过眼底病变的病理检查结果再次应证了糖宁通络胶囊对糖尿病并发视网膜病变的干预效果明显,二甲双胍组病变 损伤程度与db/db模型组相似未有防治缓解趋势。糖尿病肾病是最为严重的慢性并发症之一,是导致终末期肾病的主要原因之一,典型临床表现的病理基础是微血管病变,表现为细胞外基质的堆积,肾小球基底膜增厚和血管壁的滤过屏障功能受损,最终形成肾小球硬化和肾小管间质纤维化。通过两次肾脏病理检查,结果提示糖宁通络胶囊对糖尿病并发的肾脏病变有一定的干预作用。第二次试验,通过对肾功能指标血清肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)检测和尿液蛋白半定量检查 结果均提示糖宁通络胶囊能一定程度降低肾功能损害,对糖尿病并发的微血管病变有较好的干预作用。

 

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